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1、标本处理
（1）.有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。
（2）.无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min.，取沉渣涂片染色。

3、染色
一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解，
都常呈阴性反应。

注意事项：
1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。
2．玻片通过火焰温度不能太高。
3．碘液变透明，则不能使用。
4．水洗时动作要轻柔,沿载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
5. 涂片之前，应事先在背面做好圆圈标记，以便判断后续试验的位置。

Gram stain is probably one of the most commonly used staining procedures used in the field of microbiology. It is one of the differential stains that are used to characterize bacteria in one of two groups: either gram positive bacteria or gram negative bacteria.

<p background-color:#ffffff;"="" style="margin-bottom: 10px; color: rgb(43, 43, 43);">Being a mordant, gram's iodine forms a complex with crystal violet in the stain that has attached more tightly to the cell wall of gram positive bacteria than that of the gram negative bacteria.

Whereas the gram positive bacteria stain violet as a result of the presence of a thick peptidoglycan layer in the walls of their cell, the gram negative bacteria stain red, due to the thinner peptidoglycan layer in their cell wall (a thicker peptidoglycan layer allows for the retention of the stain, but a thinner layer does not).